關(guān)鍵詞搜索： 高低氧動物培養(yǎng)系統(tǒng)，口腔材料試驗設(shè)備，蛋白結(jié)晶設(shè)備，納米顯微操縱儀，果蠅相關(guān)研究，各類培養(yǎng)箱體，顯微鏡相關(guān)配件，力學(xué)設(shè)備

無基質(zhì)（Scaffold-Free）3D細胞球體的制備解析

細胞在體內(nèi)緊密的空間排列使得單個細胞之間以及細胞與細胞外基質(zhì)之間能夠進行復(fù)雜的相互作用。這種排列為細胞提供了的線索，以指導(dǎo)特定的細胞功能和生長。為了在體外復(fù)制這種空間排列，可以在三維（3D）培養(yǎng)系統(tǒng)中培養(yǎng)細胞，使細胞與細胞聚集形成球體。讓細胞聚集成細胞球體的無基質(zhì)（SCAFFOLD-FREE）3D細胞球體培養(yǎng)是構(gòu)建3D細胞球較為常見的方法。其原理基于貼壁細胞趨向于聚集的生物特性，如腫瘤細胞、肝細胞等。

現(xiàn)階段，已有多種方法構(gòu)建細胞球體，如維持細胞在培養(yǎng)基中的懸浮培養(yǎng)（懸滴法、磁懸浮法、旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)法），或是利用低粘附孔板（U型板等）。不同的培養(yǎng)方法優(yōu)缺點是怎樣的？該如何選擇？相應(yīng)的3D細胞球體檢測和分析方法有哪些？本期，EFL從3D細胞球體的制備、檢測及應(yīng)用三方面進行闡述，供大家參考與學(xué)習(xí)。

Scaffold-Free 3D 細胞球體制備方法

1. 懸滴法

簡介：細胞通過重力沉積在懸掛液滴的底部，并逐漸形成球狀體。將一小滴細胞懸液（體積為10-30μL）種植在微孔板的蓋子上，然后將微孔板倒置，使細胞在重力作用下積聚在液滴的底部。

優(yōu)點：具有高通量制備細胞球狀體的潛力。

缺點：懸滴法通常涉及小體積液體操作，定期更換培養(yǎng)基和細胞染色都需要較高的實驗操作技能。此外，它耗時且勞動密集，難以實現(xiàn)3D多細胞球體的長期培養(yǎng)。

2. 磁懸浮

簡介：利用磁場將含有納米顆粒的氧化鐵細胞團簇在一起形成球狀體。

優(yōu)點：可控制細胞群的幾何形狀，能實現(xiàn)不同種細胞在共培養(yǎng)過程中的多細胞聚集。

缺點：細胞球體的大小和形狀難以控制，均勻性差。

3. 旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)

簡介：通過模擬微重力將細胞保持在動態(tài)液體中。沿其水平軸旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)容器以混合細胞。通過調(diào)節(jié)反應(yīng)器的速度，可以將流體沖擊力和剪切力降至。形成3D細胞球體后，反應(yīng)器繼續(xù)以特定速度旋轉(zhuǎn)，以防止球體相互聚結(jié)。

優(yōu)點：可模擬人體內(nèi)的動態(tài)條件，適用于細胞的長期培養(yǎng)，便于大規(guī)模生產(chǎn)等。

缺點：培養(yǎng)系統(tǒng)依賴性大，培養(yǎng)對象只能是各相同性的組織和器官，如軟骨、肝等，不適于各相異性的組織器官。

4. 超低粘附 U 型底多孔板

簡介：非貼壁表面方法使細胞聚集成球狀體，盡可能的降低細胞貼附、蛋白吸收和酶活性，維持細胞以懸浮不貼壁的狀態(tài)生長。

優(yōu)點：非粘附表面培養(yǎng)方法方便簡潔，可實現(xiàn)3D球體的長期培養(yǎng)和異質(zhì)細胞的共培養(yǎng)。

缺點：對細胞活性要求較高，并不適用于所有細胞形成細胞球。

細胞球體檢測方法

1. 形態(tài)分析

光學(xué)顯微鏡：可測量直徑、面積、周長、固體度、圓度和球形度等屬性。

電子顯微鏡可以觀察到粗糙度、孔隙、通道和其他參與細胞-細胞相互作用的結(jié)構(gòu)，存在結(jié)構(gòu)倒塌、制備和鍍金步驟導(dǎo)致球體形態(tài)發(fā)生變化的風(fēng)險。

聚焦離子束掃描電子顯微鏡(FIB-SEM)可自動生成z軸分辨率較高的三維圖像，近年來已被應(yīng)用于大尺度三維球體成像。

透射電鏡技術(shù)則用于更詳細地分析球體中的超微結(jié)構(gòu)區(qū)室。

2. 細胞活力定性分析，用于三維內(nèi)部結(jié)構(gòu)和細胞周期的表征

共聚焦激光掃描顯微鏡：可以觀察球體的不同層，對于光線穿透受阻的大球體的分析不太有效，可通過將球體冷凍切片來解決。然而，由于切割過程本身，切片可能會產(chǎn)生三維結(jié)構(gòu)的形態(tài)畸變，需要使用軟件工具將切片連接起來，重建完整的球體圖像。

光片熒光顯微鏡(LSFM)：不需要樣品切片就可觀察樣品3D結(jié)構(gòu)，能夠穿透更深的樣品。但雙光子的信號很弱，采集速度非常慢，不適合對大樣品進行動態(tài)成像，其成本較昂貴。

雙光子和多光子顯微鏡系統(tǒng)：具有超高靈敏度的直接探測器能記錄組織深層最細微的內(nèi)部結(jié)構(gòu)，可有效地收集來自深層組織的微弱光子，使圖像更明亮。

3. 球狀體中活細胞的定量

球狀體中活細胞的數(shù)量可以通過直接方法(如手動或自動計數(shù))和間接方法(通過比色法和生物發(fā)光測定)來確定。

直接法：球體必須分解成單獨的細胞，這一過程的難度取決于組成球體的細胞類型以及細胞產(chǎn)生的ECM的特征。

間接法包括比色法和生物發(fā)光法。比色法基于細胞攝取染色劑的能力，當(dāng)分離或聚集成球狀時，球體內(nèi)化合物擴散的定量方法可能會顯示差異。生物熒光法被證明更可靠、更敏感、顯色化合物干擾更低、速度更快，因為不需要染色潛伏期，而使用其他方法時可能需要幾個小時。

具體的檢測方法可參考往期EFL推文“細胞增殖與活性檢測的“規(guī)矩"?總有一條適用你"

4. 基因表達譜

蛋白質(zhì)印跡法（免疫印跡試驗）即Western Blot可識別細胞裂解液中轉(zhuǎn)錄的蛋白質(zhì)的存在，它是分子生物學(xué)、生物化學(xué)和免疫遺傳學(xué)中常用的一種實驗方法。

5. 細胞代謝

目前用于分析球形代謝功能的分析可以使用分析細胞外流的設(shè)備，并通過細胞外酸化率測量糖酵解，通過耗氧率測量氧化磷酸化。

6. 人類細胞圖譜（HCA）

HCA方法，這項技術(shù)是提高圖像捕獲效率、圖像處理算法和開發(fā)可靠的數(shù)據(jù)分析軟件的結(jié)果。HCA有潛力應(yīng)用于單個細胞、構(gòu)成球體的一組特定亞群或整體聚集的熒光標(biāo)記的分析，而不需要細胞分離。HCA需要自動顯微鏡，通常是熒光或共聚焦顯微鏡，以及強大的數(shù)據(jù)分析和存儲軟件，這導(dǎo)致初始投資很高。

細胞球體應(yīng)用

1、藥物療效和毒性試驗:藥物篩選

2、器官發(fā)育和先天性疾病的探究

3、大規(guī)模組織工程的發(fā)展：生物制造

4、生物3D打印

5、增加系統(tǒng)復(fù)雜性:微流體和高通量平臺