2017諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)，果蠅助攻，帶你解讀生物鐘機(jī)制

理論上與生物鐘相關(guān)的問題中zui重要的，是迄今理解不多的睡眠。理解生物鐘可以解釋睡眠的相位（何時(shí)睡），但不能解釋睡眠本身。睡眠的機(jī)理目前理解很少。教科書中睡眠的內(nèi)容相當(dāng)大部分是腦電圖的描繪，是現(xiàn)象的描述不是機(jī)理的理解。

2017年諾貝爾生理學(xué)或醫(yī)學(xué)獎(jiǎng)授予三名美國(guó)科學(xué)家邁克爾·楊（Michael W Young）、杰弗理·霍爾（Jeffrey C Hall）、邁克爾·羅斯巴希（Michael Rosbash），以表彰他們?cè)谘芯可镧娺\(yùn)行的分子機(jī)制方面的成就。

 評(píng)獎(jiǎng)委員會(huì)說，人們過去知道，包括人類在內(nèi)的許多生物都有內(nèi)在的生物鐘，但其中原理卻長(zhǎng)期不清楚。這些科學(xué)家以果蠅為對(duì)象，分離出能夠控制晝夜節(jié)律的基因，并在分子層面揭示了相關(guān)蛋白質(zhì)的工作機(jī)制。

運(yùn)氣，外在而縹緲；

勇氣，內(nèi)生而實(shí)在。

運(yùn)氣不會(huì)尋找勇氣；

勇氣可能碰到運(yùn)氣。

在研究生物鐘基因的過程中，事先難以預(yù)料能否取得突破，事后分析發(fā)現(xiàn)勇氣足以成功，而運(yùn)氣是錦上添花，雖然花開的特別燦爛。

生物鐘是生物體內(nèi)周而復(fù)始的節(jié)律，如人們熟知的：動(dòng)物的晝行夜伏、植物的春華秋實(shí)…。常見的近24小時(shí)晝夜節(jié)律（circadian rhythm）是典型的生物鐘之一。

生物鐘現(xiàn)象看似簡(jiǎn)單，其實(shí)不盡然。人們熟知的向日葵朝向太陽，并非每天太陽先出來、向日葵后轉(zhuǎn)向，而是向日葵先朝向、而后才有太陽姍姍來遲。

生物鐘的本質(zhì)難以入手，研究不容易。人們用電生理方法研究而不得入門，1971年從果蠅的一個(gè)基因出發(fā)開啟了生物鐘的基因研究，23年后才發(fā)現(xiàn)哺乳動(dòng)物*個(gè)生物鐘基因的突變，26年后明確哺乳類的生物鐘基因與果蠅的類似，30年后才發(fā)現(xiàn)同果蠅一樣的基因也控制人類生物鐘。

驅(qū)動(dòng)生物鐘的內(nèi)在機(jī)理隨著一個(gè)一個(gè)基因的發(fā)現(xiàn)和研究，逐漸明朗，從果蠅到人存在同樣一批控制生物鐘的基因，它們編碼的蛋白質(zhì)合作共事，節(jié)律性地調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)的基因轉(zhuǎn)錄，都采用了負(fù)反饋模式，并與光和溫度等外界因素協(xié)調(diào)，從而對(duì)應(yīng)于地球自轉(zhuǎn)的近24小時(shí)節(jié)律。

生物鐘的存在和意義

生物節(jié)律與其他節(jié)律一樣，有震蕩的幅度、周期、相位。

節(jié)律是生物鐘的外在表現(xiàn)，生物鐘是內(nèi)在的定時(shí)機(jī)理。生物鐘本身是自我維持的生理和行為節(jié)律發(fā)生器（pacemaker），可以受外界環(huán)境因素（zeitgebers）所導(dǎo)引、從而同步化。

生物有多種節(jié)律，不同的生物有著不同的節(jié)律，同一生物也有多種節(jié)律。有些動(dòng)物每年一個(gè)周期的冬眠、有些植物每年一個(gè)周期的長(zhǎng)葉落葉，動(dòng)物還有更快的周期如呼吸和心跳…，而人們熟知的節(jié)律是晝夜節(jié)律。不僅大家熟悉的睡眠有晝夜節(jié)律，很多其他行為和生理指標(biāo)也有晝夜節(jié)律。

現(xiàn)在知道，從簡(jiǎn)單的單細(xì)胞藍(lán)綠藻（cynobacteria）細(xì)菌到多細(xì)胞的人，很多生物有生物鐘的存在，但并不清楚是否所有地球上的生物都有晝夜節(jié)律。晝夜節(jié)律周期接近24小時(shí)（常見22至25小時(shí)）。在環(huán)境線索缺乏時(shí)可以繼續(xù)維持，節(jié)律的相位由zui后一次環(huán)境線索（如光、或溫度等）所確定。在環(huán)境噪音中，節(jié)律照常運(yùn)行。在一定范圍內(nèi)，節(jié)律周期并不隨溫度的改變而劇烈改變，有溫度補(bǔ)償機(jī)制，這不同于一般生化反應(yīng)：如溫度每上升10℃，酶的催化活性提高一倍。

晝夜節(jié)律的生物學(xué)意義目前仍不清楚。當(dāng)然在進(jìn)化過程中，生物活動(dòng)與地球自轉(zhuǎn)相匹配，也許可以節(jié)省能量、或提率。但如果沒節(jié)律又會(huì)怎么樣呢？藍(lán)綠藻有晝夜節(jié)律，把正常的藍(lán)綠藻與生物鐘周期異常的細(xì)菌在一起長(zhǎng)期培養(yǎng)，發(fā)現(xiàn)zui后生物鐘正常的細(xì)菌占了絕大多數(shù)，由此可見生物鐘對(duì)生物體有利（Ouyang et al., 1998；Woelfle et al., 2004）。擬南芥的研究也觀察到，周期縮短或延長(zhǎng)的擬南芥，其固碳量、生長(zhǎng)、存活都是與環(huán)境設(shè)定晝夜周期相吻合的擬南芥，即：短周期突變株在20小時(shí)晝夜環(huán)境下生活得更好；而長(zhǎng)周期突變株在28小時(shí)的模擬環(huán)境下更好（Dodd et al., 2005）。這些觀察，反映了只有當(dāng)內(nèi)外源周期保持一致時(shí)才zui有利于植物生長(zhǎng)。觀察到周期正常有利于植物，不等于能夠解釋為什么，所以我們?nèi)匀皇侵淙?、不知其所以然?/span>

偷懶是創(chuàng)新之母

遺傳篩選的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)是：建立檢測(cè)表型的方法，用致變劑誘導(dǎo)特定生物的不同基因發(fā)生突變，檢測(cè)不同突變種的表型。具體到果蠅的生物鐘，就應(yīng)該是建立檢測(cè)生物鐘的方法，用化學(xué)誘變劑誘導(dǎo)不同基因突變，然后一只一只檢測(cè)果蠅，以便發(fā)現(xiàn)改變了晝夜節(jié)律的突變種。

當(dāng)時(shí)沒人知道果蠅有約兩萬個(gè)基因，化學(xué)分子誘發(fā)隨機(jī)突變，只做兩萬只果蠅不夠，其中部分突變?cè)谙嗤?，所以?yīng)該加幾倍，才可能大部分基因都突變過一次。因行為有漂移，一個(gè)基因的突變種，不能僅檢測(cè)一只果蠅，應(yīng)該檢測(cè)幾只到幾十只。果蠅是二倍體，每個(gè)基因有兩套，一套壞了可以被另一個(gè)等位基因所代償，所以不要做子一代（F1）的篩選，而是F2代，傳代后再篩選，而F2代只有四分之一是同一基因突變的純合子那么需要篩選的數(shù)量應(yīng)一兩百萬，才算做過全基因組的篩選。

檢測(cè)果蠅晝夜節(jié)律的標(biāo)準(zhǔn)方法，是將單只果蠅放到透明的管中，管子只容一只果蠅來回走動(dòng)。一束光射過小管的中央，凡是果蠅走過管中央，計(jì)算機(jī)就記錄果蠅運(yùn)動(dòng)了一次。以此檢測(cè)果蠅活動(dòng)的變化，發(fā)現(xiàn)確實(shí)有晝夜規(guī)律。如檢測(cè)很多果蠅，工作量比較大。

Konopka和Benzer用了兩個(gè)偷工減料方法來加快速度。其一是果蠅遺傳學(xué)*的attached X，可以快速檢測(cè)X染色體的突變。其二是他們決定不篩選晝夜節(jié)律，而篩另一節(jié)律：果蠅羽化。果蠅受精卵成為胚胎，發(fā)育成為幼蟲，三次蛻皮后成為蛹，蛹經(jīng)過羽化成為成蟲。

晝夜活動(dòng)節(jié)律是果蠅成蟲每天經(jīng)歷一次、幾十天周而復(fù)始的循環(huán)。而果蠅一生僅羽化一次。羽化一般在黎明前，zui遲也在上午。三十年代到五十年代的研究明確提出羽化為獨(dú)立于溫度的生物鐘所控制（Kalmus，1935，1940a，1940b，Pittendrigh，1954）。但是，一生一次的羽化的生物鐘與成蟲每天的活動(dòng)生物鐘，是否有關(guān)，當(dāng)時(shí)并不清楚。

Konopka覺得羽化作為篩選方法很容易操作。用單只果蠅做經(jīng)典的晝夜活動(dòng)規(guī)律檢測(cè)比較慢。如果用羽化作為篩選方法，就很便當(dāng)：化學(xué)誘變處理得到各種突變的果蠅猴，Konopka每天上午不來上班，午后到實(shí)驗(yàn)室把所有羽化的果蠅倒掉，留下其他蛹，下午到晚上再羽化的就是影響節(jié)律的突變種，因?yàn)樗鼈兊挠鸹瘯r(shí)間不同于正常（所謂“野生型”）果蠅。這樣的方法大大簡(jiǎn)化了檢測(cè)、加速了篩選。

運(yùn)動(dòng)監(jiān)視器

羽化監(jiān)視器

對(duì)于一個(gè)研究生來說，用如此簡(jiǎn)單的方法，不難篩選幾萬只、幾十萬只、幾百萬只果蠅。但Konopka只篩選了不到兩百種品系的果蠅就得到*個(gè)突變品系，繼續(xù)篩選不到兩千種品系的果蠅再得到兩個(gè)突變品系。

他們用羽化篩到突變品系后，更重要的是用標(biāo)準(zhǔn)檢測(cè)運(yùn)動(dòng)的晝夜節(jié)律之方法看個(gè)體的晝夜活動(dòng)是否變化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)確實(shí)突變果蠅的運(yùn)動(dòng)晝夜節(jié)律異常。有趣的是，他們發(fā)現(xiàn)的三種品系的突變果蠅在表型上并不相同：一種沒有節(jié)律，一種節(jié)律周期長(zhǎng)短加快到19小時(shí)，一種節(jié)律變慢到28小時(shí)。他們進(jìn)一步將突變種與已有的其他突變交配，確立三種突變?cè)谌旧w圖譜的大概位置，結(jié)果發(fā)現(xiàn)很近，他們進(jìn)一步把三種突變相互交配，進(jìn)行本哲發(fā)明的順反檢測(cè)，試圖確立它們是否同一基因，他們根據(jù)得到的結(jié)果推測(cè)三種突變可能是同一個(gè)基因的不同突變。他們把這個(gè)基因命名為period（簡(jiǎn)寫per），無節(jié)律的為per0（per zero）、節(jié)律短的為pers（per short）、節(jié)律長(zhǎng)的為perl（per long）。這里需要說明，他們進(jìn)行的順反檢測(cè)并不嚴(yán)格，只做了反位（trans）的檢測(cè)沒做順位（cis）的檢測(cè)，所以只從1971年的文章不能*斷定三個(gè)突變是否同一基因，雖然當(dāng)時(shí)的結(jié)果支持這一可能。

他們篩選的果蠅數(shù)量不多，卻得到了一個(gè)基因的三種不同方向的突變，因此顯得特別有運(yùn)氣。

各種篩選和檢測(cè)生物鐘的方法，都有可能在一些非生物鐘關(guān)鍵的基因?qū)е碌耐蛔兌兴绊憽Ｍ粋€(gè)基因可以出現(xiàn)三個(gè)方向的突變，不僅是運(yùn)氣，而且對(duì)于這個(gè)基因的功能也提供了很好的支持：很難設(shè)想不參與驅(qū)動(dòng)生物鐘的基因可以導(dǎo)致三個(gè)不同方向的突變表型。如果三個(gè)突變確為一個(gè)基因的三種突變，那么per基因很可能是生物鐘的關(guān)鍵基因之一。

果蠅與哺乳類是否有類似的分子機(jī)理？

如果果蠅的per基因只是在果蠅和昆蟲起作用，那么意義就有限。如果找到高等動(dòng)物的Per并因此開啟研究高等動(dòng)物生物鐘的分子機(jī)理，那么意義就較大。

果蠅的per基因在1984年被克隆后，長(zhǎng)期有人（如麻省大學(xué)伍斯特校區(qū)的Steven Reppert）試圖在高等動(dòng)物中找到Per基因，但無果。一般來說，一個(gè)基因在低等動(dòng)物中發(fā)現(xiàn)后，在高等動(dòng)物中比較容易找到，有多種方法可以通過DNA序列相似性找到。找不到有幾種可能：Per在高等動(dòng)物不存在，例如果蠅的生物鐘可能高等動(dòng)物的生物鐘不同，也可以是果蠅和高等動(dòng)物生物鐘大體類似但其中有分子不同（如果蠅用per但高等動(dòng)物不用）；另一可能是研究者技術(shù)上的問題，在高等動(dòng)物存在Per基因，但未被找到。從1984年到1997年的努力都找不到哺乳動(dòng)物的per基因的情況下，很多人灰心地認(rèn)為恐怕哺乳類無Per。

1997年，兩個(gè)實(shí)驗(yàn)室歪打正著，找到老鼠和人的Per（Tei et al., 1997；Sun et al., 1997）。美國(guó)華人科學(xué)家在研究其他問題的時(shí)候，發(fā)現(xiàn)一個(gè)基因與per有序列相似性（Sun et al., 1997）。比較它們后知道，以前沒找到的原因是哺乳類的Per與果蠅的per基因在整個(gè)基因的相似性不很高，而局部很高。以前用整體去找很難找到，而用局部的困難在當(dāng)時(shí)并不知道哪段是保守的。

哺乳類的Per基因有三個(gè)：Per1、Per2、Per3（Shearman et al., 1997），Per基因表達(dá)在SCN（Shearman et al., 1997），其表達(dá)隨晝夜節(jié)律變化而變化，這一節(jié)律受Clock基因的調(diào)節(jié)（Jin et al., 1999）。

1998年，霍爾—羅斯巴希組通過遺傳篩選，也在果蠅找到Jrk基因，發(fā)現(xiàn)就是果蠅的clock基因（Allada et al., 1998）。有趣的是，Steve Kay實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)clock蛋白可以激活帶有per基因啟動(dòng)子片段E-box驅(qū)動(dòng)的熒光素（luciferase）報(bào)告基因的表達(dá)，這一激活能被per自身所抑制，從而較好地實(shí)現(xiàn)負(fù)反饋環(huán)路的閉合（Darlington et al., 1998）。

首先在果蠅發(fā)現(xiàn)的per基因終于在哺乳類找到了，而首先在老鼠發(fā)現(xiàn)的基因Clock也在果蠅中發(fā)現(xiàn)了，從昆蟲到哺乳類，生物鐘的基因看來高度保守。這雖然是基因水平，但提示機(jī)理也保守。

從研究來說，鉆研果蠅生物鐘的科學(xué)家們就不用再擔(dān)心是自己怪癖，而確實(shí)可能是探討和揭示動(dòng)物相通的普遍機(jī)理。